Bakterielle smøreegenskaper og forberedelse



den bakteriell smøring er en forlengelse i form av en tynn film av en suspensjon av bakterielle mikroorganismer som utføres på en gjennomsiktig glassplate eller lysbilder, for observasjon under et optisk mikroskop.

Utvidelsen i form av film utføres for å separere mikroorganismer så mye som mulig, fordi hvis de er gruppert, er observasjonen ikke klar.

I studiet av bakteriekulturer brukes teknikker for smearpreparasjon, fiksering og farging til å analysere dem bedre. På grunn av mikroorganismens små størrelse er det nødvendig å bruke et optisk mikroskop for dets observasjon.

De optiske mikroskoper er uunnværlige instrumenter for observasjon av utstrykningene. Disse bruker optiske linser og lys som tillater visualisering av prøvene med stor økning i størrelse.

Levende celler har generelt ikke strukturer som hovedsakelig er farget, sett gjennom det optiske mikroskopet de er fargeløse, gjennomsiktige prøver, og viser svært liten intern kontrast og med omgivelsene.

Observasjonen med det enkle lysfeltmikroskopet, uten bruk av hjelpefargingsteknikker, er svært begrenset og brukes bare i noen tilfeller, som i observasjonen av bevegelsen av mikroorganismer.

For å observere mikroorganismer optimalt må en balanse mellom kontrast og oppløsning oppnås. Detaljene av cellene kan ikke observeres under et mikroskop, selv ved høy oppløsning; bruk av fargestoffer er nødvendig gjennom fargingsteknikker, som gir kontrast for observasjon.

index

  • 1 Kjennetegn ved en god kvalitet bakteriell smøring
    • 1.1 Utmerket kontrast
    • 1.2 God løsning
    • 1.3 God flekker
  • 2 Fremstilling
    • 2,1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fiksering
    • 2.3 C. Enkel farging
    • 2.4 D. Endelig oppbevaring av smeten
  • 3 referanser

Kjennetegn ved en god kvalitet bakteriell smøring

Utmerket kontrast

For å oppnå en utmerket kontrast er det såkalte sofistikerte mikroskoper fasekontrastmikroskop, differensial interferens og mørkt feltmikroskop. Denne typen mikroskop brukes til å observere bakterielle strukturer som f.eks. Kappe og filamenter.

Staining er en enkel teknikk for å øke kontrasten som oppnås med et klart feltmikroskop. I denne teknikken kan forskjellige farger brukes som merkbart forbedrer observasjonen under mikroskopet.

Flekkene gjøres direkte på smørene eller forlengelsene av suspensjonene av mikroorganismer på lysbildene, tidligere tørket og fikset.

God løsning

Fiksering er en teknikk som brukes til å bevare cellulære strukturer; forårsaker inaktivering av mikroorganismer og adhesjon til glasset av lysbildet. Det finnes ulike fikseringsbehandlinger: varmefiksering og kjemisk fiksering.

Varmefiksering

Dette er metoden mest brukt i observasjon av bakteriell smøring. Teknikken består i å overføre bakteriell suspensjon av smøret ved en lighters flamme. Denne teknikken er i stand til å bevare bakteriens eksterne morfologi, men ødelegger deres indre strukturer.

Kjemisk fiksering

Kjemisk fiksering bruker kjemikalier i konservering, for eksempel formaldehyd eller formaldehyd, etanol og eddiksyre, blant andre. Fordelen med å bruke kjemiske fikseringsmidler er at oppnåelsen av de indre cellestrukturene til mikroorganismer oppnås.

God flekker

De vanligste prosedyrene for farging av et tidligere tørket og fast smear er positiv eller enkel farging, differensial farging og negativ farging. Det er også spesielle teknikker for farging av bestemte cellestrukturer (kapsel, spore, flagella).

Positiv farging eller enkel farging

Positiv eller enkel farging er den mest brukte flekkfargeteknikken. Bruker farger som har evne til å binde seg til bestemte mikrobielle strukturer, slik at de blir observert under et mikroskop.

Disse fargene har kromoforiske grupper (farget del) i sin kjemiske struktur, med alternerende dobbeltbindinger og enkle bindinger (konjugering). Disse bindingene kan i sin tur etablere ioniske eller kovalente bindinger med noen cellulære strukturer.

Farger som brukes i positiv eller enkel farging er for det meste kjemiske derivater av anilin (fargede organiske salter).

På den annen side, blant fargestoffene, finner vi noen med grunnleggende pH og andre med sur pH.

Grunnleggende fargestoffer

I basiske fargestoffer har kromoforegruppen en positiv elektrisk ladning. De aller fleste prokaryotiske mikroorganismer har en nøytral intern pH, og deres celleoverflate er negativt ladet. Gjennom denne elektrostatiske interaksjonen binder kromoforen seg til cellen og farger den.

Eksempler på basiske fargestoffer er metylenblått, fiolett krystall, malakittgrønn, grunnleggende fuscin, safranin, blant andre.

Syrefarger

I syrefarger har kromoforegruppen en negativ elektrisk ladning. Disse brukes til farging av proteiner med positivt ladede aminogrupper. Eksempler på syrefarger er sur fuskin, rose Bengal, Kongo rød og eosin.

Differensiell farging

Teknikken for differensiell farging består i å anvende to farger av forskjellig farge eller intensitet for å skille forskjellige mikroorganismer under mikroskopet. Gramfarging og syre-alkoholbestandig farging er de mest brukte forskjellig flekker i bakteriologi.

Gramfarging brukes som en foreløpig test for å kjenne form, størrelse, cellegruppering, i tillegg til typen cellevegg. Gjennom Gram-flekkprøven klassifiseres bakterier med cellevegg som Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier.

Negativ farging

I denne teknikken brukes kjemiske fargestoffer som ikke trenger inn i det cellulære interiøret, men de gjør det mediet der mikroorganismer vises som en svart bakgrunn.

I teknikken for negativ farging er smeten laget med en dråpe suspensjon av kinesisk blekk eller nigrosin, som etter å ha tillagt tørking ved romtemperatur danner en film ugjennomsiktig til lysets passasje. På denne måten blir mikroorganismer observert som lyse former på en mørk bakgrunn.

forberedelse

A. Smøre

1. Vask glidene veldig bra, tørk med absorberende papir og merk dem. Etiketten må angi innholdet i preparatet, dato og navn på personen som behandlet den.

2.- Lys lighteren og steriliser inokuleringssløyfen i flammen til det er rødt varmt.

3.- La håndtaket avkjøles.

4. Ta røret av bakteriekulturen, fjern lokket og fort pass munnen av røret i nærheten av flammen til lighteren (flammen).

5.- Innfør injeksjonssløyfen inne i røret som inneholder bakteriekulturen og ta prøven.

6.- Hvis kulturen er i flytende medium, plasser prøven tatt med håndtaket i midten av lysbildet og fordel det forsiktig i en sirkel med en diameter på ca 2 cm.

7.- Re-steriliser inokuleringssløyfen.

8.- Tillat tørking av smeten i luften.

9. Gjenta trinn 3 til 8 tre ganger.

10.- Hvis kulturen er i fast medium, skal en dråpe destillert vann tidligere plasseres på lysbildet. Dette gjøres for å blande en liten prøve av kulturen tatt med inokulasjonshåndtaket, i henhold til indikasjonene på trinn 2 til 5 (tilstandene for asepsis).

11.- Utvann den fortynnede prøven med vanndråpet på lysbildet og gjenta tre ganger.

B. Fiksering

1.- Legg til de tørre smørene - produsert fra kulturer i flytende medium, to dråper metanol eller absolutt etanol.

2.- Tillat tørking i luften bort fra lighteren.

3.- Hvis smøret kommer fra en kultur i fast medium, er det tørre smøret festet med varme, passerer det 2 til 3 ganger raskt gjennom de heteste områdene av tennflammens flamme.

4.- Berør undersiden av smøret med den dorsale delen av venstre hånd (for høyre hånd, ellers bruk høyre hånd) og kontroller at det er kaldt.

C. Enkel farging

1.- Legg 2 dråper av det valgte fargestoffet til smøret og la det virke for tiden som kreves i de spesifikke protokollene for hvert fargestoff (vanligvis mellom 1 og 5 minutter).

2.- Noen fargestoffer krever bruk av varme for aktivering, i så fall er det nødvendig å være veldig forsiktig når du oppvarmer lysbildet i lighterens flamme (manipuler det med pinsett og unngå koking). Overoppheting av smeten kan ødelegge cellene du ønsker å observere.

3. Fjern overflødig fargestoff ved å vaske med destillert vann fra et piktett. Fjern vaskevannet ved å forsiktig tappe glidebryteren på kanten, vippet på arbeidsbordet.

4.- Tillat lufttørking.

5.- Avhengig av type observasjon, brukes et dekselglass eller ikke i dette stadiet. Dekselglasset beskytter og bevarer smeten. Hvis en observasjon gjøres ved nedsenkning i olje på dette stadiet, blir det ikke brukt et deksel, men smøret kan ikke bevares.

D. Endelig bevaring av smeten

1.- Senk smøret suksessivt i hver av løsningene som er angitt nedenfor, i minst 5 minutter. Hensikten med disse "badene" er å la smøret være helt dehydrert. Hvert reagens må dreneres, før det smøres i neste bad.

Ordren til dehydreringsbadene er som følger:

  1. Etanol 70%
  2. 95% etanol
  3. Ren aceton
  4. Bland aceton-xylol 1: 1
  5. xylen

Tillat deretter lufttørking.

2.- Monter dekselet, fortrinnsvis 22 × 22 mm, med kanadisk balsam eller andre måter å montere.

referanser

  1. Briggs, G. (1965). Årsakssymptomer i mikrobiologiske laboratorieulykker og infeksjoner. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. og Welch, C.T. (2017). Mikrobiologi: En laboratoriehåndbok. Pearson.
  3. Holt, J.G. Editor. (1977). Den kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8th Baltimore: Williams og Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. og tilfelle; C.L. (2018). Laboratorieeksperimenter i mikrobiologi. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.