Urea buljong foundation, forberedelse og bruk

den urea buljong er et flytende dyrkingsmedium, som brukes til å demonstrere tilstedeværelsen av enzymet urease i visse mikroorganismer. Urease er et mikrobielt enzym som produseres konstitutivt, det vil si, det syntetiseres uavhengig av om substratet som det virker på er tilstede eller ikke.

Funksjonen av urease er relatert til dekomponering av organiske forbindelser. Ikke alle mikroorganismer er i stand til å syntetisere dette enzymet, derfor bestemmer dets bestemmelse i laboratoriet å identifisere bestemte bakteriestammer og til og med skille mellom arter av samme slekt..

Det finnes to typer ureatest: Stuart og Christensen. De varierer i sammensetning og følsomhet. Den første er spesiell for å vise en stor mengde urease produsert av arter av slekten Proteus.

Den andre er mer følsom og kan påvise små mengder av urease forsinket generert av andre bakterielle, såsom Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, og Helicobacter slektene Mycobacterium.

Stuart urea-buljong består av urea, natriumklorid, dikaliumfosfat, monokaliumfosfat, gjærekstrakt, fenolrød og destillert vann.

Mens Christensen-buljong eller agar urea består av peptoner, natriumklorid, monokaliumfosfat, glukose, urea, fenolrødt, destillert vann og agar-agar. Sistnevnte bare hvis det er det faste medium.

index

• 1 Foundation
  • 1,1 Stuart urea kjøttkraft
  • 1,2 Christensen buljong eller agar urea
  • 1.3 Fortolkning av begge medier (Stuart og Christensen)
• 2 Fremstilling
  • 2.1 Stuart urea buljong
  • 2.2 Christensen kjøttkraft eller agar urea
• 3 bruksområder
• 4 Såning av urea-testen
• 5 Kvalitetskontroll
• 6 Referanser

fundament

Enzym ureasen hydrolyserer urea for å danne karbondioksid, vann og to molekyler ammoniakk. Disse forbindelsene reagerer for å danne det endelige produktet kalt ammoniumkarbonat.

Stuart urea kjøttkraft

Stuart urea-buljongen er mer bufferert med en pH på 6,8. Derfor må mikroorganismen kunne danne store mengder ammonium for å bli rød til fenol. PH må stige over 8.

Derfor er Stuart urea-buljongen selektiv for Proteus-arter, noe som gir positive resultater i 24 til 48 timer inkubering, og er ikke effektiv for bakterier som produserer lave mengder urease eller som sakte hydrolyserer urea.

Dette skyldes at Proteus-arter kan bruke urea som nitrogenkilde. I motsetning til dette trenger andre urease-produserende bakterier en ekstra kilde.

Imidlertid Pérez et al. (2002) har fastslått at urinstoff kokes Stuart var så effektiv som Christensen urea-agar for å bestemme urease i gjærstammer av slektene Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon og Saccharomyces.

Forfatterne av studien hevder å ha oppnådd 100% tilfeldighet med begge medier (Stuart og Christensen) ved inkubering i 24 og 48 timer; forutsatt at de tok like positive stammer som klarte å snu media til en sterk rosa-fuchsia-farge.

Denne avklaringen er nødvendig, siden Lodder (1970) bekreftet at nesten alle gjærene klarer å plassere skarpheten av urea agar fra Christensen til blekrosa. Dette skyldes at de kan hydrolysere urea i minimale mengder, og til dannelsen av aminer ved oksydativ dekarboksylering av aminosyrene på overflaten. Dette bør ikke tolkes som positivt.

Broth eller urea agar fra Christensen

Christensen urea-buljong eller agar er mindre bufferert, og er i stand til å oppdage små mengder ammonium. I tillegg er dette mediet beriket med peptoner og glukose. Disse forbindelsene forårsaker andre urease-produserende mikroorganismer som ikke vokser i Stuart-buljongen for å utvikle seg.

På samme måte gir Christensen urea-test raskere resultater, spesielt for Proteus, som kan gi sterkt positiv på så lite som 30 minutter som minimumstid og opptil 6 timer som maksimal tid.

Resten av urease-produserende mikroorganismer klarer å snu fargene til mediet litt etter 6 timer, og sterkt etter 24, 48, 72 timer eller mer, og selv noen stammer kan gi svake reaksjoner etter 5 eller 6 dager.

Tolkning av begge medier (Stuart og Christensen)

Mediet er opprinnelig gul-oransje i farge og en positiv reaksjon vil forvandle fargene til mediet til rosa-fuchsia. Fargens intensitet er direkte proporsjonal med mengden av produsert ammonium.

En negativ reaksjon vil etterlate mediet av den opprinnelige farge unntatt gjærene, som kan gi en blekrosa med Christensen urea agar.

forberedelse

Stuart urea kjøttkraft

Veie det nødvendige gramet i henhold til indikasjonene på det kommersielle huset. Oppløs i fortrinnsvis sterilt destillert vann. Ikke bruk varme for å oppløse, fordi urea er følsom overfor varme.

Membranfiltreringsmetoden brukes til sterilisering. For dette brukes et Millipore filter med porer på 0,45 μm i diameter. Ikke bruk en autoklav. Når løsningen er filtrert, fordeles den i sterile rør. For å oppnå pålitelige resultater, må det overføres mellom 1,5 ml som minimumsmengde til 3 ml som maksimal mengde per rør..

Oppbevares i kjøleskap og temperament før bruk.

Hvis filtreringsmetoden ikke er tilgjengelig, bør mediet brukes umiddelbart for å oppnå pålitelige resultater.

En annen måte å forberede urea Stuart kjøttkraft på er som følger:

Noen kommersielle hus selger den halve basen for urea-testen, ikke inkludert urea.

Beløpet som er oppgitt av det kommersielle huset, veies. Den oppløses i destillert vann og steriliseres i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. La det hvile litt, og når mediet er varmt, tilsett 100 ml av en oppløsning av urea tilberedt til 20% og steriliseres ved filtrering.

Den er fordelt i sterile rør, som tidligere beskrevet.

Broth eller urea agar fra Christensen

-Fremstilling av ureaoppløsningen

Vekt 29 gram dehydrert urea og oppløs i 100 ml destillert vann. Bruk filtreringsmetoden til å sterilisere. Ikke autoklaver.

-Urea base agar

Oppløs 24 g av dehydrerte basaragar i 950 ml destillert vann. Steriliser i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. La stå til den når en temperatur på 50 ° C og tilsett det tidligere preparerte urea aseptisk.

Hell 4 til 5 ml i sterile rør og vippe til det er størket. Det bør være en lang fløyte-topp.

Dette mediumet kan også fremstilles i flytende form.

søknader

Urea-testen er ekstremt effektiv for å skille Proteus-slekten fra andre slektninger av Enterobacteriaceae-familien, gitt den raske reaksjonen som ble gitt av Proteus.

Hvis sammensetningen av Christensen brukes, bidrar testen til å skille mellom arter av samme slekt. For eksempel, S. haemolyticus og S. warneri spå Staphylococcus koagulase negativ og betahemolytisk, men de adskiller seg i det S. hemolyticus det er negativt urea og S. warneri det er positivt urea.

På den annen side brukte McNulty vellykket 2% Christensen urea buljong for å studere tilstedeværelsen av Helicobacter pylori i prøver av biopsier tatt fra mageslimhinnen (antralregionen).

Tilstedeværelsen av H. pylori det er påvist med en positiv ureatest. Varigheten til å observere resultatene er direkte proporsjonal med mengden av mikroorganismer tilstede.

Som det kan sees, er det en enkel metode for diagnose av Helicobacter pylori i gastrisk biopsi.

Endelig er denne testen også nyttig for å skille arter av slektene Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus og Mycobacteria.

Såing av urea-testen

De to metodene krever et sterkt mikrobielt inokulum for å optimalisere resultatene. Bakteriekolonier tas fortrinnsvis fra blodagar og Sabouraud-agargjær, med noen unntak. Inokulumet emulgeres i det flytende medium.

For Stuart urea-buljongen inkubert ved 37 ° C i 24 til 48 timer, å vite at man bare ser etter stammer av slekten Proteus når stammen er en bakterie. For gjær kan den inkuberes ved 37 ° C eller ved romtemperatur i 24 til 48 timer inkubasjon.

I tilfelle av Christensen urea-buljong inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. Hvis testen er negativ, kan den inkuberes i opptil 6 dager. Hvis testen er positiv før 6 timer, indikerer den at det er en stamme av slekten Proteus.

I tilfelle av Christensen urea agar, er agarskråten sterkt inokulert uten punktering. Buljongen inkuberes og fortolkes på samme måte.

Kvalitetskontroll

Kontrollstammer kan brukes til å teste mediet, for eksempel Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 og Salmonella typhimurium.  De to første må gi positive resultater og de to siste negative resultatene.

referanser

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Bruk av Stuart urea-buljong for urease-testen, som en test i diagnostisering av gjær. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Tilgjengelig på: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose av Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
5. Laboratorier Britania. Christensen Medio (Urea agar base) 2015. Tilgjengelig på: britanialab.com