Begrensningsenzymer fungerer, virkningsmekanisme, typer og eksempler



den restriksjonsenzymer de er endonukleaser som brukes av visse arkea og bakterier for å hemme eller "begrense" spredningen av virus inni dem. De er spesielt vanlige i bakterier og er en del av deres forsvarssystem mot fremmed DNA kjent som restriksjon / modifikasjonssystemet.

Disse enzymene katalyserer kutting av dobbeltstrenget DNA på bestemte steder, reproducerbart og uten bruk av ekstra energi. De fleste krever tilstedeværelse av koaktorer som magnesium eller andre divalente kationer, selv om noen også krever ATP eller S-adenosylmetionin.

Restriksjon endonukleaser ble oppdaget i 1978 av Daniel Nathans, Arber Werner og Hamilton Smith, som mottok Nobelprisen for medisin for deres oppdagelse. Navnet stammer vanligvis fra organismen der de blir observert for første gang.

Slike enzymer er mye brukt i utviklingen av DNA kloning metoder og andre molekylærbiologi og genetisk strategier. Egenskapene ved anerkjennelse av bestemte sekvenser og evne til å kutte sekvenser nær anerkjennelsessteder gjør dem kraftige verktøy i genetisk eksperimentering.

Fragmentene som genereres av restriksjonsenzymer som har virket på et bestemt DNA-molekyl, kan brukes til å gjenskape et "kart" av det opprinnelige molekylet ved å bruke informasjon om de stedene hvor enzymet kutter DNA'et.

Noen restriktjonsenzymer kan ha det samme anerkjennelsessite i DNA, men de kutter ikke nødvendigvis det på samme måte. Dermed er det enzymer som gjør kuttene forlater stumme ender og enzymer som kutter forlater kohesive ender, som har forskjellige anvendelser i molekylærbiologi.

For tiden er det hundrevis av forskjellige kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymer, tilbys av forskjellige kommersielle hus; Disse enzymene fungerer som "tilpassede" molekylære saks til forskjellige formål.

index

  • 1 Funksjoner
  • 2 Handlingsmekanisme
  • 3 typer
    • 3.1 Type I restriksjonsenzymer
    • 3.2 Type II restriksjonsenzymer
    • 3.3 Type III restriksjonsenzymer
    • 3.4 Type IV restriksjon enzymer
    • 3,5 Type V restriksjonsenzymer
  • 4 eksempler
  • 5 referanser

funksjoner

Begrensningsenzymer tjener den motsatte funksjon av polymeraser, siden de hydrolyserer eller bryter esterbindingen i fosfodiesterbindingen mellom tilstøtende nukleotider i en nukleotidkjede.

I molekylærbiologi og genteknologi er de mye brukt verktøy for konstruksjon av uttrykks- og kloningsvektorer, samt for identifisering av spesifikke sekvenser. De er også nyttige for konstruksjonen av rekombinante genomer og har stort bioteknologisk potensial.

Nylige fremskritt i genterapi gjør nåværende bruk av restriksjonsenzymer for innføring av bestemte gener i vektorer som er kjøretøy for transport av slike gener til levende celler, og som sannsynligvis har muligheten til å bli satt inn i cellegenomet for å utføre permanente endringer.

Handlingsmekanisme

Begrensningsenzymer kan katalysere kutting av dobbeltstrenget DNA, selv om noen er i stand til å gjenkjenne enkeltstrengede DNA-sekvenser og til og med RNA. Skjæringen skjer etter anerkjennelsen av sekvensene.

Virkningsmekanismen består i hydrolysen av fosfodiesterbindingen mellom en fosfatgruppe og en deoksyribose i ryggraden i hver DNA-streng. Mange av enzymene er i stand til å kutte på samme sted de gjenkjenner, mens andre kutter mellom 5 og 9 par baser før eller etter det..

Normalt kutter disse enzymene ved 5'-enden av fosfatgruppen, noe som gir opphav til DNA-fragmenter med en 5'-fosforylend og en terminal 3'-hydroksyl-ende.

Siden proteiner ikke kommer i direkte kontakt med anerkjennelsesstedet i DNA, må de translokeres suksessivt til de når det spesifikke området, kanskje ved hjelp av "glidende" mekanismer på DNA-strengen..

Under den enzymatiske kutt er fosfodiesterbindingen av hver av DNA-strengene plassert i et av de aktive steder av restriksjonsenzymer. Når enzymet forlater anerkjennelses- og skjæreområdet, gjør det det gjennom ikke-spesifikke forbigående foreninger.

typen

For tiden er det kjent fem typer restriktjonsenzymer. Nedenfor, en kort beskrivelse av hver:

Type I restriksjonsenzymer

Disse enzymene er store pentameriske proteiner med tre underenheter, en restriksjon, en metylering og en annen for gjenkjenning av sekvenser i DNA. Disse endonukleaser er multifunksjonelle proteiner som er i stand til å katalysere restriksjons- og modifikasjonsreaksjoner, de har ATPase-aktivitet og også DNA-topoisomerase.

Enzymer av denne typen var de første endonukleaser som ble oppdaget, de ble renset for første gang på 1960-tallet og siden da har de blitt studert med stor dybde.

Type I-enzymer brukes ikke mye som et bioteknologisk verktøy, siden skjæreområdet kan ha en variabel avstand på opptil 1000 basepar fra anerkjennelsessiden, noe som gjør dem upålitelige når det gjelder eksperimentell reproduserbarhet.

Type II restriksjonsenzymer

De er enzymer sammensatt av homodimerer eller tetramerer som kutter DNA på definerte steder mellom 4 og 8 bp i lengde. Disse skjærestedene er vanligvis palindromiske, det vil si at de gjenkjenner sekvenser som leses på samme måte i begge retninger.

Mange av type II-restriktjonsenzymer i bakterier kutter DNA når de anerkjenner deres fremmede karakter, siden de ikke har de typiske modifikasjonene som eget DNA burde ha..

Disse er de enkleste restriktjonsenzymer, siden de ikke krever noen annen kofaktor enn magnesium (Mg +) for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvensene.

Nøyaktigheten av type II-restriksjonsenzymer ved å gjenkjenne og kutte enkle sekvenser i DNA i presise posisjoner, gjør dem til en av de mest brukte og uunnværlige i de fleste grener av molekylærbiologi.

Innenfor gruppen av type II er restriksjon enzymer flere underklasser klassifisert i henhold til visse egenskaper som er unike for hver enkelt. Klassifiseringen av disse enzymene gjøres ved å legge til bokstaver i alfabetet, fra A til Z etter navnet på enzymet.

Noen av underklassene mest kjent for deres brukervennlighet er:

Underklasse IIA

De er dimere av forskjellige underenheter. De anerkjenner asymmetriske sekvenser og brukes som ideelle forløpere for generering av skjæreenzymer.

Underklasse IIB

De er sammensatt av en flere dimere og kuttet DNA på begge sider av gjenkjenningssekvensen. De kutter begge DNA-strengene i en rekke basepar utover anerkjennelsesstedet.

Underklasse IIC

Enzymer av denne type er polypeptider med funksjoner for oppdeling og modifisering av DNA-tråder. Disse enzymene kutter begge strengene asymmetrisk.

Underklasse IIE

Enzymer av denne underklassen er de mest brukte i genteknologi. De har et katalytisk sted og krever generelt en allosterisk effektor. Disse enzymene må samhandle med to kopier av deres anerkjennelsessekvens for å gjøre en effektiv kutt. Innenfor denne underklassen er enzymerne EcoRII og EcoRI.

Type III restriksjonsenzymer

Type III restriktionsendonukleaser består av bare to underenheter, den ene er ansvarlig for DNA-gjenkjenning og modifisering, mens den andre er ansvarlig for å kutte sekvensen.

Disse enzymene krever to kofaktorer for deres funksjon: ATP og magnesium. Begrensningsenzymer av denne type har to asymmetriske gjenkjenningssites, translaterer DNAet på en ATP-avhengig måte og kutter den mellom 20 og 30 bp ved siden av anerkjennelsessiten..

Type IV restriksjon enzymer

Type IV-enzymer er enkle å identifisere siden de kutter DNA med metyleringskoder, de består av flere forskjellige underenheter som er ansvarlige for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvensen. Disse enzymer bruker som cofaktorer GTP og divalent magnesium.

Spesifikke steder for kutting inkluderer nukleotidkjeder med rester av metylert eller hydroksymetylert cytosin i en eller begge strengene av nukleinsyrer.

Type V restriksjonsenzymer

Denne klassifiseringen klassifiserer enzymene CRISPER-Cas-typen, som identifiserer og kutter spesifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer. Cas-enzymer bruker en streng av CRISPER-syntetisert styrende RNA for å gjenkjenne og angripe invaderende organismer.

Enzymer klassifisert som type V er polypeptider strukturert av type I, II og II enzymer. De kan kutte deler av DNA i nesten hvilken som helst organisme og med et stort utvalg av lengder. Deres fleksibilitet og brukervennlighet gjør disse enzymer til et av de mest brukte verktøyene innen genteknologi i dag sammen med type II-enzymer.

eksempler

Begrensningsenzymer har blitt brukt til påvisning av DNA-polymorfismer, særlig i studier av populasjonsgenetikk og evolusjonære studier ved bruk av mitokondrielt DNA, for å oppnå informasjon om hastighetene for nukleotid-substitusjoner..

I dag har vektorer som brukes til transformasjon av bakterier med forskjellige formål, multikloningssteder hvor genkende steder for flere restriksjons enzymer er funnet..

Blant disse enzymene er de mest populære EcoRI, II, III, IV og V, oppnådd og beskrevet for første gang E. coli; HindIII, fra H. influenzae og BamHI er B. amyloliquefaciens.

referanser

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biologi av DNA-restriksjon. Mikrobiologiske vurderinger, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Gir kjøpt motstand mot virus i prokaryoter. vitenskap, 315(Mars), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Det molekylære perspektivet: Restriction Endonucleases. Stamceller grunnlag for kreftmedisin, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Hopping, hopping og looping av restriksjonsenzymer. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Vedlikehold av artidentitet og kontrollerende spesiering av bakterier: En ny funksjon for restriksjon / modifikasjonssystemer? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins gener XII (12 utg.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Hun, Q. (2015). Harnessing Type I og Type III CRISPR-Cas systemer for genomredigering. Nucleic Acids Research, 1-12.
  8. Loenen, W. A. ​​M., Dryden, D. F., Raleigh, E. A., & Wilson, G. G. (2013). Type I restriksjonsenzymer og deres slektninger. Nucleic Acids Research, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriksjon Endonucleases i analysen og restrukturering av DNA molekyler. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). DNA-polymorfisme detekterbar ved restriksjonsendonukleaser. genetikk, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Type II restriksjonsendonukleaser: struktur og mekanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Hvordan restriksjon enzymer ble arbeidshestene i molekylærbiologi. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., og Murray, K. (1976). Restriksjon endonukleaser. Kritiske omtaler i biokjemi, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Homing endonuclease struktur og funksjon. Kvartalsoversikt av biofysikk, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologien av begrensning og anti-restriksjon. Nåværende mening i mikrobiologi, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N.E. (1991). Begrensning og modifikasjonssystemer. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisk innsikt i Campylobacter jejuni virulens og populasjonsgenetikk. Infisere. Dis. Transl. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktur og mekanisme for multifunksjonelle restriktionsendonukleaser. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.