DNA-sekvensering Maxam-Gilbert, Sanger-metode, eksempler



den DNA-sekvensering (deoksyribonukleinsyre) er en prosedyre utført i molekylærbiologilaboratorier som tillater kjennskap til rekkefølgen av nukleotider i det genetiske materialet av interesse. I tillegg kan sekvenseringen av RNA (ribonukleinsyre) også avsløres.

Denne teknikken har vært uunnværlig for utviklingen av biologiske fag. Det gjelder også for andre felt av kunnskap - for eksempel medisinsk diagnose og rettsmedisinske undersøkelser.

Tidligere ble sekvenseringen av en DNA-streng ansett som en langsom og dyr aktivitet, som tillot identifisering av bare noen få basepar i oligonukleotidene.

I dag, med alle fremskritt innen vitenskap, er DNA-sekvensering en rutinemessig operasjon i mange laboratorier over hele verden takket være bidraget fra nesten 50 års forskning på dette feltet. Når det gjelder lengden på kjeden, kan du sekvens opp til millioner av basepar på kort tid.

For å gjøre det, er det dusinvis av utviklet teknikker som varierer i pris og nøyaktighet. I denne artikkelen vil vi beskrive både klassiske og moderne teknikker, hver med sine fordeler og ulemper.

Så langt tillater sekvenseringsteknikker å oppnå sekvensen av komplette genomer, fra små prokaryoter og gjær til det humane genom.

index

  • 1 struktur av DNA
  • 2 historie
  • 3 Sanger-metoden
    • 3.1 Hovedkomponenter av reaksjonen
    • 3.2 Leser resultatene
  • 4 Automatisk sekvensering
  • 5 Maxam-Gilbert-sekvensering
    • 5.1 Prosedyre
    • 5.2 Lesing av resultatene
  • 6 Massiv sekvensering
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Sekvensering ved syntese
    • 6.3 Sekvensering ved ligering
    • 6.4 Sequencing Ion Torrent
  • 7 Eksempler
    • 7.1 Sekvenseringen av det humane genom
  • 8 Viktighet og applikasjoner
  • 9 referanser

Struktur av DNA

For å forstå metodene og teknikkene som brukes til DNA-sekvensering, er det nødvendig å vite visse viktige aspekter ved molekylets struktur og sammensetning.

DNA er en biomolekyl som finnes i alle levende ting, fra bakterier til store vannsklier. Organelles - som mitokondrier og kloroplaster - har et sirkulært DNA-molekyl inne i dem. Selv i noen virus er det genetiske materialet som er funnet DNA.

Strukturelt er DNA et sett av nukleotider. Hver enkelt er integrert med et karbohydrat, en nitrogenbasert base (A, T, C eller G) og en fosfatgruppe. Målet med DNA-sekvensering er å avsløre rekkefølgen der de fire nitrogenholdige basene er funnet i sekvensen.

historie

I midten av 1950-tallet beskrev forskere Watson og Crick strukturen av DNA ved hjelp av kristologiske teknikker. Ingen av disse forskerne hadde imidlertid kunnet finne en måte å avdekke sekvensen på.

Selv om det var noen forgjengere, den viktigste hendelsen var opprettelsen av Sanger-metoden, i 1977. Frederick Sanger, faren til den metoden var en britisk biokjemiker, vinneren av to Nobelpriser for sine enorme bidrag til de biologiske vitenskaper.

Denne teknikken er også kjent i litteraturen som "kjedeavslutning" eller dideoxynukleotider. Deretter skal vi beskrive prinsippene for denne teknikken og de som ble utviklet basert på forbedring og innovasjon av dette.

Sangerens metode

Utviklingen av Sanger-metoden representerte en viktig begivenhet i molekylærbiologi. Det involverer de grunnleggende komponentene i DNA-replikasjonsprosessen som normalt forekommer i cellen, men ved å legge til en spesiell komponent: dideoxynukleotider.

Hovedkomponentene i reaksjonen

- DNA-polymerase: enzymet DNA-polymerase er et viktig element i prosessen. Dette molekylet deltar i replikasjonen av DNA-strengen, og dens rolle er syntesen av den nye kjeden, som matcher deoksyribonukleotid-trifosfatet med de komplementære.

Husk at den DNA-tymin (T) å passe sammen med adeniner (A) til og med to hydrogenbindinger, mens cytosin (C) danner med guanin (G) med tre broer.

- Nukleotider Sanger-sekvensering innebærer to typer nukleotider, 2'-deoksynukleotider fire (forkortet som dATP, dGTP, dTTP og dCTP) og de fire Dideoksynukleotider (ddATP, ddGTP ddCTP og ddTTP) Spesial.

Selv om dideoxynukleotider ligner monomerer som normalt innlemmes i DNA, mangler de en -OH gruppe i deres struktur. Dette gjør det umulig å legge til et nytt nukleotid i kjeden.

Derfor, når et spesielt nukleotid tilsettes - på en helt tilfeldig måte - til kjeden i formasjon, blir syntesen paralysert. På denne måten, på slutten av reaksjonen, er det kjeder av forskjellige størrelser, hver hvor reaksjonen ble stoppet på et annet punkt.

Eksperimentelt utarbeides fire forsøk. Hver inneholder DNA ekstrahert fra den biologiske prøven av interesse, de normale nukleotidene og en av de fire typer spesielle nukleotider. Eller de spesielle nukleotidene er merket med en eller annen type fluorescerende markør (se nedenfor automatisert sekvensering).

Lesing av resultatene

Det første trinnet er å skille hver av de syntetiserte kjedene i henhold til deres størrelse. Noen vil være lengre enn andre, avhengig av hvor de spesielle basene ble innlemmet.

Det er forskjellige biokjemiske teknikker som tillater separasjon av komponentene i en blanding ved hjelp av størrelsen som en diskriminerende egenskap. I Sanger-metoden separeres de forskjellige kjedene med elektroforese. I de mest sofistikerte varianter av teknikken brukes kapillærelektroforese.

Dermed beveger de lengre trådene mindre enn de kortere varianter. Så går dette systemet gjennom en leser som gjenkjenner markøren som er inkludert i hvert dideoxynukleotid. På denne måten kan rekkefølgen av sekvensen være kjent.

Denne "første generasjons" teknikken er i stand til å lese DNA-fragmenter som ikke er større enn 1 kilobase. I dag brukes Sanger metode i flere laboratorier, generelt i sine moderne varianter. I tillegg er det brukt til å bekrefte resultatene som er oppnådd med de mest komplekse teknikkene - men mindre presise.

Automatisk sekvensering

Når storskala-sekvensering er nødvendig, akselereres prosessen med automatisering. Dette er en variant av Sanger-kjedeavslutningsmetoden, hvor primrene er merket med fluorescerende produkter for å skille dem fra.

Deretter drives produktet av reaksjonen i en elektroforese - alt i en enkelt bane. Når hvert fragment forlater den endelige delen av gelen, identifiseres den raskt ved sin fluorescerende etikett, med en feil som omgir 1%.

De mest sofistikerte systemene har et system på opptil 96 kapillærrør som drives av en datamaskin koblet til en robot. Det vil si at 96 DNA-prøver kan evalueres samtidig. Således er prosessen som involverer elektroforese og analysen av resultatene fullstendig automatisert.

På en dag kan disse systemene sekvensere opp til 550.000 baser. Under prosessen er menneskelig arbeid unødvendig, det tar bare 15 minutter å starte metoden.

Sequencing av Maxam-Gilbert

Samtidig som Sanger publiserte sitt arbeid, klarte to forskere ved navn Allan Maxan og Walter Gilbert å utvikle en annen metode for å oppnå DNA-sekvensen. Metoden ble populær på den tiden, men ble senere forskjøvet av forbedringen av Sanger-metoden.

I motsetning til Sanger-metoden innebærer sekvenseringen av Maxan og Gilbert (eller kjemisk sekvensering, som det også er kjent) ikke hybridiseringsreaksjoner. Metoden består av merking med reaktive midler i den ene enden, etterfulgt av en renseprosess.

En av de negative aspektene ved denne teknikken ligger i sin enorme kompleksitet og i bruken av kjemikalier som er farlige for brukeren. Kjemiske sammenbrudd induceres ved anvendelse av DMS, myresyre, hydrazin og hydrazin med salter.

prosessen

Protokollen starter med merkingen ved 5'-enden av strengen med fosformarkøren 32, og deretter oppstår en kjemisk modifikasjon av den nitrogenholdige base og den skilles fra. Til slutt oppstår splittelsen av den abasiske regionen.

Først blir kjeden som skal sekvenseres forkortet til mindre segmenter. Dette trinnet utføres med restriktjonsenzymer, noe som resulterer i fremragende ekstremer.

Deretter utføres reaksjonen med en alkalisk fosfatase, hvis formål er å eliminere fosfatgruppen. Således kan en polynukleotidkinase brukes til å utføre merkingen.

Kjeden er denaturert (de to trådene åpne). Så fortsetter vi å bruke kjemikaliene. Disse spaltningsreaksjonene utføres på en kontrollert måte og hvilke typer obligasjoner brytes av hvert kjemikalie som påføres.

Lesing av resultatene

Som i Sanger-metoden involverer lesingen av resultatene adskillelsen av størrelsen av kjedene oppnådd i et elektroforesystem. Systemene sammensatt av polyakrylamid tillater å oppnå en meget tilstrekkelig oppløsning for å lese gelen.

Massiv sekvensering

Massiv sekvensering omfatter en rekke nye metoder, forkortet som NGS, fra engelsk "Next Generation Sequencing ".

Metodene som er katalogisert som NGS krever et tidligere trinn med DNA-amplifikasjon (de fungerer ikke med et enkelt molekyl). I tillegg er plattformene som brukes varierer mye. Prinsippene for de mest populære metodene vil bli beskrevet nedenfor:

pyrosekvensering

Det involverer overvåking av frigjøringen av et pyrofosfat, som oppstår hver gang et nytt nukleotid tilsettes til DNA-strengen. Et enzymsystem er koblet, slik at lysutslipp (som kan påvises av et kamera) oppstår hver gang et nytt nukleotid innlemmes.

Prosessen begynner med separat inkubering av hver nitrogenbasen for å verifisere om det er lysutslipp eller ikke. Pyrosequencing kan utføre lesing av lange tråder, men feilfrekvensen som er funnet, er høy.

Sekvensering ved syntese

Dette innebærer inkorporering av merkede nukleotider. Disse fluorescerende komponentene tilsettes, vaskes og det inkorporerte nukleotid er notert. Deretter elimineres nukleotidmerkingen, og syntesen av strengen kan fortsette. I det neste trinnet vil et merket nukleotid også bli innarbeidet, og de nevnte trinnene vil bli gjentatt.

En ulempe med denne teknikken oppstår når fluorescerende markører ikke er helt eliminert. Disse utslippene skaper bakgrunnsfeil, noe som medfører betydelige feil.

Sekvensering ved ligering

Denne teknikken varierer fra de andre, siden den ikke bruker DNA-polymerase. I stedet er nøkkelenzymet for denne metoden ligase. Her brukes DNA-fragmenter som er fluorescensmerket, bundet av enzymet og detekteres.

Det største problemet med denne teknikken er den svært korte lengden på fragmentet som er i stand til å behandle.

Ion Sequencing Torrent

Denne teknikken er basert på måling av H-ionet+ som frigjøres hver gang et nytt nukleotid innlemmes. Prinsippet er ganske lik pyrosequencing, men mye billigere.

eksempler

Sekvenseringen av det humane genom

Sequencing genomet av mennesker har vært en av de mest lovende utfordringene i biologi, i tillegg til å være en av de mest anerkjente rivaliene i vitenskapens historie. Faktisk, for forskerne involvert i prosjektet, ble sekvensering av genomet en konkurranse.

I 1990 begynte han det som ble kalt "menneskelig genomprosjekt", ledet av den berømte forskeren, vinner av Nobelprisen, James Watson. Etter ett år, i 1991, tar Venter utfordringen med å "slå" Watson og sekvensere genomet før han. Men i 1992 dro Watson og kommandoen ble tatt av en annen forsker.

I 1995 annonserte Venter sin suksess i den fullstendige sekvensering av et bakteriegenom ved tilfeldig sekvenseringsmetode. På samme måte kunngjorde det motsatte laget et år senere sekvenseringen av gjærgenomet.

I år 2000 ble rase avsluttet. Begge selskapene publiserte sine foreløpige resultater av det komplette genomet i to av de mest prestisjefylte tidsskriftene i vitenskapen: natur og vitenskap.

Men forskerne fortsatte å jobbe med å forbedre forslagene, og i 2006 ble sekvensene fullført visse menneskelige kromosomer.

Viktighet og applikasjoner

Å vite rekkefølgen av nukleotidene av et molekyl så viktig som DNA, er verdifullt for biologer og beslektede fagfolk. Denne kjeden av polynukleotider inneholder all den informasjonen som er nødvendig for utvikling og vedlikehold av alle livsformer.

Av disse årsakene er kunnskap om denne sekvensen avgjørende for biologisk forskning. I utgangspunktet gir sekvensering oss mulighet til å måle en av de viktigste egenskapene til biologiske systemer og å etablere forskjeller mellom dem.

Sekvensering er mye brukt av taksonomer og systematikere, siden visse DNA-sekvenser tillater etablering av kriterier for å konkludere om to organismer tilhører samme art eller ikke, samt å kunne foreslå hypoteser om fylogenetiske forhold mellom dem..

I tillegg har DNA-sekvensering anvendelser innen medisin og diagnostikk. For eksempel er det rimelige og tilgjengelige systemer som ved hjelp av sekvensering tillater oss å vurdere tendensen til å utvikle visse sykdommer (som kreft) ved hjelp av de såkalte enkle nukleotidpolymorfiene (SNP)..

Undersøkelsene av den kriminalistiske og rettsmedisinske typen har også blitt beriket med sekvenseringsteknikker, og kan brukes som pålitelige bevis for deltakelse av et bestemt individ i en forbrytelse.

referanser

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvensen av sekvenser: historien til sekvensering av DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Den neste generasjonen av sekvenseringsrevolusjon og dens innflytelse på genomikk. Cell, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Vitenskapelig rivalisering. Fra Galileo til det menneskelige genomprosjektet. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA-sekvensering med kjede-terminerende inhibitorer. Foredrag av det nasjonale akademiet for naturvitenskap, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Neste generasjons sekvensering forvandler dagens biologi. Naturmetoder, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Neste generasjons sekvensering. Caister Academic Press.