Voges-Proskauer test fundament, forberedelse og bruk



den Voges-Proskauer test er en biokjemisk test som brukes til å identifisere bakterier som tilhører familien Enterobacteriaceae. Spesielt er det nyttig å skille mellom stammer av Escherichia coli av Klebsiella og Enterobacter, blant annet.

Testen utføres i det flytende dyrkingsmedium kalt methyl red-Voges Proskauer, bedre kjent med akronymet RM / VP. Dette medium er sammensatt av bufret polypepton, glukose, dikaliumfosfat og destillert vann.

Nåværende RM / VP-medium er en modifikasjon av Clark og Lubs-mediumet, som opprinnelig inneholdt en lavere konsentrasjon av peptoner og glukose. Derfor ble mindre hydrogen ion produsert, kreves for den positive Voges-Proskauer-reaksjonen.

Testen er basert på mikroorganismens evne til å bruke glukose via butylenglykol-ruten, og danner et nøytralt sluttprodukt kalt acetoin, i nærvær av oksygen og en alkalisk pH.

I RM / VP-mediumet, i tillegg til å kunne avsløre Voges-Proskauer-testen, kan den metylrøde testen også avsløres.

index

  • 1 Foundation
    • 1.1 Grunnlaget for Voges-Proskauer-testen
    • 1.2 Grunnlag for utvikling av test og tolkning
  • 2 Fremstilling
    • 2,1 medium RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Voges B Reagens
  • 3 Prosedyre for Voges-Proskauer-testen
    • 3.1 Utvikling av testen
  • 4 Bruk
  • 5 Kvalitetskontroll
  • 6 Referanser

fundament

Grunnlag for Voges-Proskauer-testen

De pluripeptoner som er til stede i mediet, gir næringsbehovene essensielle for bakteriell vekst. For sin del er glukose hovedforbindelsen. Mange bakterier har evnen til å metabolisere glukose og danne pyruvsyre.

Pyruvinsyren er et midtpunkt i glukosemetabolismen og derfra kan hver mikroorganisme ta forskjellige veier. Noen vil danne blandede syrer, slik som melkesyre, eddiksyre, myresyre og ravsyre, og andre vil danne nøytrale produkter som 2,3-butandiol.

Voges-Proskauer-testen avslører mikroorganismenes evne til å danne acetylmetylkarbinol (aketoin), et mellomprodukt av 2,3-butandiol under aerobiske forhold.

Acetoin reduseres og danner 2,3-butandiol, men denne reaksjonen er reversibel, så hvis 2,3-butandiol oksyderes, dannes acetoin. Derfor er oksygen avgjørende.

Dik Kaliumfosfat er bufferen som demper blandingen ved en pH på 6,9 ± 0,2..

Grunnlag for utvikling av test og tolkning

For å demonstrere reaksjonen må det utføres en utvikling ved bruk av to reagenser (Barrit reagenser), kjent som Voges A og Voges B.

Voges A er en 5% løsning av a-naftol, og Voges B er et 40% kaliumhydroksydpreparat. Hvis kaliumhydroksid ikke er tilgjengelig, kan det erstattes med 40% natriumhydroksyd.

Α-naftol er en katalysator som vil øke intensiteten av reaksjonsfargen, noe som gjør testen mer følsom. A-naftol må alltid legges først, rør røret slik at mediet kommer i kontakt med oksygen. På denne måten oksyderes acetoinet til diacetyl, og 2,3-butandiolet oksyderes for å danne acetoin, som overføres til diacetyl.

Dette er hvordan a-naftol vil binde til diacetyl, som igjen har vært knyttet til guanidinkjernen tilstede i aminosyren arginin, sistnevnte kommer fra pluripeptonas.

For sin del er kalium eller natriumhydroksid ansvarlig for å absorbere CO2 og reagere med peptonene. Denne reaksjonen forårsaker dannelsen av en rosa-laks farge, tydelig synlig etter risting av røret veldig bra.

For farging skal oppstå øyeblikkelig, må korrekte mengder diacetyl, pepton og a-naftol blandes. Hvis dette ikke skjer, la røret hvile i 15 minutter før tolkning.

Vanligvis er testen positiv etter 2 til 5 minutter, når en svak rosa farge kan observeres. Hvis du går i ro i 30 minutter til 1 time, vil fargens intensitet være maksimal (dyprød).

En negativ test vil bli tydelig når kjøttkraft er gul. Etter 1 time, hvis testen er negativ, kan en kobberfarge dannes som et resultat av reaksjonen av kaliumhydroksyd på a-naftol.

forberedelse

Middels RM / VP

Veid 17 g av dehydratiserte dyrkingsmediet og oppløs i 1 liter destillert vann. La stå i 5 minutter. Varm opp til koking for å oppløse helt. Server 3 til 4 ml i rør og steriliser i autoklav ved 121 ° C i 15 minutter.

Det dehydrerte dyrkningsmediet er beige, og det fremstilte medium er lysegult.

Den endelige pH i mediet er 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Veie 5 g a-naftol og oppløs i 50 ml etylalkohol (absolutt). Deretter fortsetter å tilsette etylalkohol for å gjøre opp til 100 ml.

Reagens Voges B

Veie 40 g kaliumhydroksyd og oppløs i 50 ml destillert vann i et beger. Glasset skal plasseres i et kaldvannsbad for å kontrollere temperaturen, fordi oppløsningen når oppløsningen stiger kraftig.

Etter at løsningen er kald, blir den overført til en oppgradert ballong og brakt opp til 100 ml med destillert vann.

Fremgangsmåte for Voges-Proskauer-testen

For å utføre Voges-Proskauer-testen, blir en RM / VP-buljong inokulert med mikroorganismen som studeres, fra en ren kultur på 18 til 24 timer.

Inokulumet skal ikke være for tett. Den inkuberes ved 35-37 ° C i 24 til 48 timer, selv om noen ganger inkubering er nødvendig i flere dager. Cowan og Steel mener at 5 dager er den minste inkubasjonstiden nødvendig for å oppdage alle positive Voges-Proskauer (VP) arter av familien Enterobacteriaceae.

Utvikling av testen

Separat en 1 ml alikvot i et rør og utfør utviklingen som følger: Legg 12 dråper (0,6 ml) Voges A reagens og 4 dråper (0,2 ml) Voges B. Bland for å lufte og la stå i 5 - 10 minutter før du utfører. Men hvis testen fortsatt er negativ, la den stå og observere røret etter 30 minutter til 1 time.

Utseendet til en rosa-rød farge indikerer at Voges-Proskauer-reaksjonen er positiv. Hvis mediet blir gul, er reaksjonen negativ.

Tillegget av utviklerne i den angitte rekkefølgen og mengden er viktig for å unngå falske negativer.

bruk

Voges-Proskauer-testen er nyttig for å skille mellom stammer av E. coli som er VP-negativ, blant slektene Klebsiella, Enterobacter, Serratia, blant andre, som er VP-positive.

Kvalitetskontroll

Kontrollstammer kan brukes til å teste kvaliteten på det tilberedte mediet. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium og Enterobacter cloacae ATCC 13047.

De forventede resultatene er positive Voges-Proskauer-reaksjoner bare for K. pneumoniae og E. cloacae. Resten gir negative reaksjoner.

referanser

  1. Laboratorier Britania. MR-VP Medium. 2015. Tilgjengelig på: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Tilgjengelig: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose av Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.