Agar Müeller Hinton grunnlag, forberedelse og bruk

den Müeller Hinton agar Det er et solidt, ikke-selektivt næringsmedium, som består av kjøttinfusjon, kaseinsyrepepton, stivelse, agar og destillert vann. Dette mediet tillater en utmerket mikrobiell utvikling av de raskest voksende bakteriene.

Det ble opprinnelig opprettet av John Howard Müeller og Jane Hinton for å isolere ernæringsmessige krevende bakterier, for eksempel Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis. På grunn av egenskapene viste det seg seg å være ideelt for studiet av sensitiviteten til antibiotika, og gir pålitelige og reproducerbare resultater.

Derfor er det Mueller Hinton agar kulturmediet akseptert av de kliniske og laboratorie Standards Institute (CLSI) og europeisk Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing for gjennomføring av antimikrobiell følsomhetstesting ved diffusjon metode disk Kirby og Bauer.

index

• 1 Foundation
• 2 Fremstilling
• 3 bruksområder
  • 3.1 Antimikrobiell teknikk
  • 3.2 Strategisk plassering av plater på Müeller Hinton agar
• 4 årsaker til feilaktige resultater
• 5 Begrensning
• 6 Kvalitetskontroll
• 7 referanser

fundament

Fordi det er et ikke-selektivt næringsmiddel, er det utmerket for veksten av de fleste patogene bakterier.

På den annen side gjør dens enkle sammensetning stoffene lett diffusere på den, idet det er en viktig egenskap for følsomhetstesten ved hjelp av diskdiffusjonsmetoden..

En annen egenskap er at den inneholder en lav mengde hemmere, noe som gjør at sulfonamider, trimethoprim og tetracykliner kan evalueres effektivt..

Det må imidlertid tas i betraktning at mediet må oppfylle visse forhold for å sikre at den fungerer, inkludert:

PH-justering, agardybde og tilstrekkelig konsentrasjon av tymin, tymidin, Ca⁺⁺, mg⁺⁺ og Zn⁺⁺.

Vi må også vite at metoden er standardisert og derfor må alle parametere oppfylles, for eksempel:

Podestoff-konsentrasjon, konsentrasjon og bevaring av antibiotikaskivene, plassere et passende antall av plater på agar, avstanden mellom en plate og annen strategisk plassering av visse antibiotika, atmosfære, temperatur og tid inkubasjon.

forberedelse

Veie 37 g av det dehydrerte Müeller Hinton-mediumet og oppløs i 1 liter destillert vann. Varm mediet under omrøring for å hjelpe oppløsningen. La koka i 1 minutt.

Ta autoklaven til å sterilisere ved 121 ° C i 15 minutter. Når du fjerner fra autoklaven, skal fiolaen plasseres i et vannbad ved 50 ° C for å avkjøles. Hell 25 til 30 ml i sterile petriskåler 10 cm i diameter.

Plattene skal ha en gjennomsnittlig tykkelse på 4 mm (ideell), med et område på 3-5 mm tillatt.

Hvis det er ønskelig å fremstille blodagar med bruk av Müeller Hinton-agarbase, helles 5% sterilt og defibrinert lammeblod før det serveres på platene..

Den endelige pH i mediet bør være mellom 7,2 og 7,4.

Invester og lagre i kjøleskap, til bruk. La platen ta romtemperatur før bruk.

Fargen på det fremstilte mediet er lys beige.

søknader

Det brukes til å utføre antibiogrammet eller antibiotikaresistens testen til de fleste ikke-raskt voksende patogener.

Hvis agar er tilsatt blod, tjener det til å utføre antibiogrammet av krevende mikroorganismer som: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, blant annet. Det har også blitt brukt til å isolere Legionella pneumophila.

Antibiogramteknikk

Før antibiogrammet utføres, må en bakterieløsning tilsvarende 1,5 x 10 fremstilles⁸ celle.

For å gjøre dette tar 3 til 4 kolonier fra renkultur og er opphengt i en trypticase soyamedium eller Mueller Hinton-buljong, ble inkubert i 2 til 6 timer, og konsentrasjonen ble justert med steril saltløsning, sammenlignet med en standard McFarland av 0,5%.

Hvis de krever mikroorganismer, kan kolonier suspenderes direkte til de når konsentrasjonen på 0,5% av Mac Farland. Deretter blir Müeller Hinton-platen sådd med en vattpinne impregnert med den tilberedte bakterieoppløsningen.

For å gjøre dette, dip døren i løsningen og fjern deretter overflødig væske ved å trykke mot rørets vegger. Umiddelbart etter at vattpinnen er passert over hele overflaten, etterlater ingen uberørte steder, drei deretter platen litt og sug den igjen. Operasjonen gjentas 2 ganger.

La stå i 10 minutter, og legg deretter antibiotikumskivene med sterile tang og la en plass på 24 mm mellom dem. Etter å ha plassert hver plate på agar, trykk lett hver med klemmen for å sikre at de holdes godt fast.

Etter prosessen blir platen omvendt og inkubert ved 35-37 ° C i aerobiose i 16 til 18 timer. Hvis det er en krevende mikroorganisme, kan det kreve mikroerofili og hvis antibiogrammet inneholder oksacillinskiver, bør det leses ved 24 timer.

En linjal brukes til å måle diameteren til hver halo. Resultatene skal registreres i mm. Deretter er verdiene som er oppnådd korrelert med tabellene med kuttpunkter publisert av gjeldende CLSI manual.

Rapporter som sensitiv (S), mellomliggende (I) eller motstandsdyktig (R), alt etter omstendighetene.

Antibiotika velges i henhold til den isolerte mikroorganismen og typen av infeksjon som forekommer.

Noen ganger bør strategisk plassering av antibiotika vurderes å vise fenotypiske resistensmønstre.

Strategisk plassering av plater på Müeller Hinton agar

For enterobakterier skal clavulansyreplaten plasseres foran 3. og 4. generasjon cefalosporiner. En eggformet utvidelse indikerer at stammen er en produsent av utvidede spektrum beta-laktamaser (ESBL). Dette betyr at pasienten ikke skal behandles med noen cephalosporin.

I Staphylococcus er det viktig å plassere erytromycin- eller azitromycinplaten foran clindamycinplaten (D-testen).

En resistent halo i erytromycin og en flatering i clindamycinhalogen indikerer at stammen har en inducerbar resistens mot clindamycin, stamme (RIC). Dette betyr at behandling med clindamycin ikke vil være effektiv.

Søk etter AMP C induserbare deformasjoner i Enterobacteriaceae og noen ikke-fermenterende Gram negative bakterier, skiver ceftazidim, cefoxitin eller piperacillin tazobactam versus imipenem skiveflaten i en avstand på 27 mm.

En halo flatet i en av platene mot imipenem indikerer tilstedeværelsen av inducerbar AMP C.

For søket etter konstitutiv AMP C står en cloxacillin 500 μg plate overfor ceftazidim (30 μg) og med cefotaxim (30 μg), i en avstand på 25 mm. En utvidet halo i en av cephalosporiner indikerer positivitet.

Cloxacillin-skiven kan også erstattes av en 9 mm plate av Whatman nr. 6 filterpapir impregnert med fenylboronsyre (400 μg) med en avstand på 18 mm. Den tolkes som den forrige.

Til slutt, for å undersøke produksjonen av metallo-beta-laktamaser, spesielt i Pseudomonas aeruginosa, impregnert brikke brukt sammen med 10 pl av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA 750 g) og tioglykolsyre (SMA 300 mg), som vender mot imipenem og meropenem plater, i en avstand på 15 mm.

Testen er positiv dersom det øker imipenem- eller meropenemhalogenet mot EDTA / SMA-disken. Dette resultatet må bekreftes av den modifiserte Hodge-testen.

Denne metoden består i å inokulere en stamme av Escherichia coli ATCC 25922 på Müeller Hinton-platen. En imipenem-disk er plassert i midten av platen, og deretter blir en fløyte laget av disken mot periferien med belastningen av P. aeruginosa mistenksom. Du kan teste opptil 4 stammer per plate.

Testen vil være positiv hvis det er en forvrengningssone for imipenemhaloen rundt stria.

Årsaker til feilaktige resultater

-Skiver av dårlig konserverte antibiotika kan produsere falske motstander. For eksempel er oksacillinskiven veldig sårbar for temperaturendringer.

-En pH i mediet under den angitte (syre) gir mindre, halo i aminoglykosider og makrolider (risiko for falsk motstand), og større haloer penicillin, tetracyclin og novobiocin (risiko for falsk følsomhet).

-Hvis pH er over det angitte (alkaliske), reverseres de ovenfor beskrevne virkninger.

-Medier med høyt tymin- og tymidinkonsentrasjoner påvirker signifikant reduksjon av inhiberingshalogenene av sulfonamider og trimetoprim.

-Høye konsentrasjoner av kalsium og magnesium gir falsk motstand av aminoglykosider, polymyxin B og tetracykliner mot stammer av Pseudomonas aeruginosa.

-Lave konsentrasjoner av kalsium og magnesium gir falske følsomheter av aminoglykosider, polymyksin B og tetracykliner mot stammer av Pseudomonas aeruginosa.

-Tilstedeværelsen av sink påvirker resultatene av karbapenems-platene (imipenem, meropenem og ertapenem).

-Tykkelsen på mediet under 3 mm gir resultater med falsk følsomhet, mens en tykkelse over 5 vil gi falsk motstand.

-Mobiliseringen av plater i antibiogrammet vil gi deformert halo, siden antibiotikumutladningen er umiddelbar.

- Svært svake inokulum påvirker resultatene, siden det ikke vil være ensartet eller sammenflyttende vekst i agar, en nødvendig betingelse for å kunne måle inhiberingssone, i tillegg til at haloene kan gi større enn normalt.

-Overbelastet inokul kan gi halo mindre enn normalt.

-Hvis du ikke respekterer avstanden mellom plater, får du en halo til å overlappe en annen og kan ikke leses riktig.

-Inkuber med CO₂ øker størrelsen på haloene av tetracyklin og meticillin-disker.

-Inkubasjon ved temperaturer under 35 ° C gir større haloer.

-Tilsetningen av blod reduserer sulfonamidernes halo-størrelse.

begrensning

Sensibiliteten til et antibiotikum demonstrert i antibiogrammet mot en mikroorganisme (in vitro) er ikke en garanti for at det vil fungere in vivo.

Kvalitetskontroll

For å vite om mediet inneholder riktig mengde thymin, bør en stamme bli sådd av Enterococcus faecalis ATCC 29212 og test følsomheten for trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), den skal gi en halo lik eller> 20 mm for å være tilfredsstillende.

referanser

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, Den frie encyklopedi. 16. november 2018, 12:23 UTC. 27. januar 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose av Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Cona E. Betingelser for en god sensitivitetsstudie ved agar diffusjonstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hinton agar med 5% saueblod. 2009. Tilgjengelig på: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar laboratorium. 2017. Tilgjengelig på: .bd.com
6. Laboratorier Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Tilgjengelig på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas type AmpC: Generelt og metoder for fenotypisk deteksjon. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Tilgjengelig på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypisk deteksjon av metallobetalaktamaser i kliniske isolater av Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Tilgjengelig på: scielo.org.