Gram flekkfundament, materialer, teknikk og bruk



den Gram flekk er den enkleste og mest nyttige fargingsteknikken i diagnostisk mikrobiologi. Denne teknikken ble skapt av den danske legen Hans Christian Gram i 1884, som klarte å klassifisere bakteriene i Gram-positiv og Gram-negativ, i henhold til sammensetningen av celleveggen.

Teknikken led modifikasjoner av Hucker i 1921 for å stabilisere de anvendte reagenser og forbedre kvaliteten av flekker, så Gram farging er også kjent som gram-Hucker.

Med denne teknikken er det også mulig å observere formet som mikroorganismer har, det vil si om de er kokki, baciller, kokobakiller, pleomorphic, filamentøse, blant andre. I tillegg til distribusjonen i rommet: i klynge, i kjede, isolert, parvis, i tetrader, etc..

Når en bakteriell infeksjon er mistenkt, bør de fleste prøvene som er mottatt, spres på et lysbilde og farget med Gram for undersøkelse under mikroskopet..

Gramens rapport vil veilede legen om hvilken type mikroorganisme som kan være årsaken til infeksjonen, før man får det endelige resultatet av avlingen.

I noen tilfeller er pasientens liv svært kompromittert, slik at leger raskt trenger Gram-rapporten til å legge en empirisk behandling mens de venter på identifisering av mikroorganismen.

For eksempel, hvis det gram viser at det Gram positive kokker i CSF, legen lede den innledende antibiotikabehandling for å eliminere disse typer av bakterier, ifølge protokoller som er fastsatt for denne.

Når det endelige resultatet kommer med navnet på den isolerte mikroorganismen og dets respektive antibiogram, vil legen vurdere om det ikke skal endres terapi. Denne avgjørelsen vil bli gjort i henhold til studien av følsomheten av mikroorganismen til antibiotika som den mottar og pasientens utvikling.

index

  • 1 Foundation
  • 2 materialer
  • 3 Fremstilling av farger og reagenser
    • 3.1 Krystallfiolett løsning
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Bleking
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Oppbevaring av reagenser
  • 5 Forberedelse av spredningen av prøven som skal farges
    • 5,1-gram av direkte prøver
    • 5,2-gram avlinger
  • 6 Teknikk
  • 7 Utility
  • 8 Vanlige feil
  • 9 referanser

fundament

Dette er en teknikk som presenterer 4 grunnleggende trinn: farging, fiksering med mordant, misfarging og kontratinksjon. Derfor skiller denne teknikken i tillegg til å fargelegge bakteriene seg også.

Krystallfioletten er det første fargestoffet som brukes. Den har en affinitet for peptidoglykan og flekk lilla alle bakterier deretter lugol, som virker som beisemiddel, som er plassert, vil indusere dannelse av uløselige komplekser av krystallfiolett-jod - ribonuclear proteiner i cellen.

Gram-positive bakterier, som har en tykk vegg av peptidoglykan, danner mer komplekser (krystallviolett-jod), derfor beholder de fargestoffet.

Det påvirker også at Gram-positiv bakterievegg inneholder en større mengde umettede syrer, som viser en høy affinitet for oksidasjonsmidler (Lugol).

I mellomtiden har Gram-negative bakterier et tynt lag av peptidoglykan, noe som gjør bakterier mindre komplekse enn gram-positive bakterier.

Deretter kommer trinnet av misfarging, hvor Gram-positive og Gram-negative bakterier oppfører seg annerledes.

Gramnegative bakterier inneholder en ytre membran rik på lipopolysakkarider som er en del av sin cellevegg. Fett er ødelagt ved kontakt med alkohol aceton, slik at ytre membran destabiliseres, den fiolette krystall blir frigjort.

Slik er det da motsatt med safranin eller grunnfuksein, og tar fargene rødt.

I tilfelle av Gram-positive bakterier motstår de misfarging fordi blekningen virker for å lukke porene, som forhindrer krystallfiolett / jodkomplekset fra å rømme.

Derfor er fargen med den fiolette krystall stabil, og det er ikke plass til safranin eller fuchsin. På grunn av dette, disse bakteriene flekker intens blå eller lilla.

materialer

Gram-fargesettet består av:

  • Violet krystall
  • lugol
  • Acetonalkohol
  • Safranin eller grunnleggende fuchsin

Fremstilling av fargestoffer og reagenser

Krystallfiolett løsning

Løsning A:

Violett krystall -2 gr

Etylalkohol 95% -20cc

Løsning B:

Ammoniumoksalat -0,8 gr

Destillert vann-80 cc

For den endelige forberedelsen av den fiolette krystallet skal 1:10 løsningen fortynnes med destillert vann og blandes med 4 deler av oppløsning B. Blandingen lagres i 24 timer før bruk. Den blir filtrert i en kolbe for ravfarget bruk ved hjelp av et papirfilter.

Mengden som skal brukes daglig, overføres til en gult flaske med dråper.

Jod-Lugols

Veie og måle den angitte mengden av hver forbindelse, som følger:

Iodos krystaller - 1gr

Kaliumjodid - 2gr

Destillert vann -300 cc

Kaliumjodidet løses litt etter litt i vannet og deretter tilsettes jod. Løsningen er barbert til en gulfarget flaske.

Mengden som skal brukes daglig, overføres til en mindre gult flaske med dråper.

bleking

95% etylalkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Den er forberedt i like deler. Dekk godt, det har en tendens til å fordampe.

Plasser i en flaske med drypp.

Dette preparatet gir en misfarging i moderat tid 5-10 sekunder og er den mest anbefalte.

Nybegynnere foretrekker å bruke bare 95% etylalkohol, hvor misfarging er langsommere fra 10 til 30 sekunder.

Mens de mest erfarne kan bruke ren aceton, hvor misfarging skjer veldig raskt fra 1 til 5 sek.

kontrast

Safranin stamløsning

Safranina -2,5 gr

Etylalkohol 95% -100 cc

Etter veiing oppløses den angitte mengden safranin i 100 ml ethylalkohol til 95%.

Arbeidet med safranin fremstilles fra stamopløsningen.

For å gjøre dette måles 10 cc av stamløsningen, tilsett 90 cc destillert vann for å fullføre 100 ml.

Det anbefales å overføre beløpet som vil bli brukt daglig til en gult flaske med en dropper.

Mikroorganismer som flekker svakt Gram-negativ med Gram-Hucker flekk, slik som visse anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp og Brucella sp, de kan bli mye bedre farget hvis modifikasjonen gjort av Kopeloff til Gram-Hucker-farging, kalt Gram-Kopeloff-flekk, brukes.

Denne teknikken endrer safraninfargen med grunnleggende fuchsin. Med denne modifikasjonen er det mulig å farge de ovennevnte mikroorganismer effektivt.

Lagring av reagenser

Forberedte fargestoffer skal oppbevares ved romtemperatur.

Forberedelse av prøve spredt til farge

En prøve må inneholde minst 105 mikroorganismer før observasjonen av mikroorganismen i et smear er sannsynlig. Sprer kan gjøres fra direkte prøve eller kulturer i fast eller flytende media.

Spredene skal være ensartede, godt fordelte og ikke for tykke, for en bedre visualisering av strukturer som er tilstede.

-Gram med direkte prøver

Urin gram uten sentrifuge

Urin blandes og 10 μl plasseres på et lysbilde. Observasjonen av minst ett bakterie / nedsenkningsfelt indikerer at det er en infeksjon.

Dette betyr at kulturen vil ha omtrent 100.000 CFU / ml (105 CFU / ml) urin i 85% tilfeller.

Denne metoden er ikke nyttig for koloni-teller under 100 000 CFU.

LCR Gram

CSF skal sentrifugeres, supernatanten fjernes og pelleten spres på et lysbilde. Denne væsken er steril under normale forhold; observasjon av bakterier indikerer infeksjon.

Gram åndedrettsprøver

Gram sputum, bronkial eller bronkoalveolar skylling, mens det kan være forskjellige mikroorganismer, alltid orientere i diagnostikk, så vel som å være nyttig type celler observert.

Når det gjelder sputum, bør smøret fremstilles med de mest purulente delene av prøven.

Avføring Gram

Det anbefales ikke å utføre Gram til denne typen prøver, siden den ikke har noen diagnostisk verdi.

-Gramavlinger

De kan gjøres på to måter, en fra flytende avlinger og en annen fra faste avlinger.

Flytende avlinger

Fra flytende kulturer er det ekstremt enkelt; under lettere flere stekte kjøttkraft skitne de blir tatt og plassert på en ren og tørr lysbilder, noe som gir en sirkulær bevegelse fra sentrum mot periferien, for å fordele materialet jevnt.

Det er lov å tørke spontant i luften. Når det er tørt, er materialet festet til platen med varme. For dette, ved hjelp av en klemme, føres arket 3 fire ganger gjennom Bunsenbrennerens flamme, passe på å ikke brenne materialet.

Laken får avkjøles og plasseres på fargebroen.

Solid avlinger

For å utføre en forlengelse for Gram-flekk fra en solid kultur, fortsett som følger:

Før du velger koloniene som skal tas, skal lysbildet være forberedt, og plassere to dråper omtrent av steril fysiologisk saltoppløsning.

Hvis den opprinnelige kulturplaten inneholder flere forskjellige typer kolonier, vil en isolert koloni av hver enkelt bli valgt for å utføre Gram. Hver koloni vil bli tatt med platina sløyfen for å oppløse den i saltoppløsningen som tidligere ble plassert på lysbildet.

Sirkulære bevegelser er gitt fra sentrum til periferien, for å fordele kolonien homogent på lysbildet..

Det er lov å tørke spontant i luften. Etter tørking er arket festet med varme, som forklart ovenfor (flamme lysbildet med lighteren), vær forsiktig så du ikke brenner materialet.

Denne prosedyren må utføres med hver annen type koloni. På et stykke papir skal rekkefølgen av de observerte noteres, for eksempel:

Koloni 1: Gul beta-hemolytisk koloni: Gram-positive kokker ble observert i klynger

Koloni 2: Kremkoloni, uten hemolyse: Gramnegative kokokobakterier ble observert.

Hvert ark må være merket for å vite hva vi observerer.

teknikk

Gramfargingsteknikk er ekstremt enkel å utføre og relativt billig og kan ikke gå glipp av i et mikrobiologi laboratorium.

Det samme gjøres som følger:

  1. Fest smøret med varme og legg på den fargede broen.
  2. Platen dekkes helt med fiolett glass i 1 minutt.
  3. Vask med vann. Ikke tørk
  4. Dekk platen med Lugol-oppløsningen, la den stå i 1 minutt. Vask med vann. Ikke tørk.
  5. Bland i 5-10 sekunder med forsiktig omrøring i acetonalkohol. Eller legg arket i oppreist stilling og slipp dråper av avfargingsmiddelet på overflaten til det gjenværende fiolette glasset blir trukket bort. Ikke overgå.
  6. Vask med vann. Ikke tørk.
  7. Bytt arket på den fargede broen og dekk i 30 sekunder med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med grunnleggende fuchsin (Gram-Kopeloff).
  8. Vask med vann
  9. Tillat å tørke spontant i vertikal luft.

Når du har tørket, plasser 1 dråpe nedsenkningsolje for å observere den under målet om 100X i det optiske mikroskop.

utility

Denne teknikken gjør det mulig å skille mellom de morphotypeintial forskjellene i de fleste bakterier.

Gjær er også preget av denne fargen. De tar krystallviolen, det vil si, de plager Gram positive.

På den annen side kan Gram-positive sporeformende baciller skelnes, hvor en klar plass observeres inne i bacillus, hvor endosporene ble dannet, selv om sporer ikke flekker godt. For å bruke sporer brukes andre teknikker som Shaeffer-Fulton.

Det skal bemerkes at denne flekken ikke tjener til å farge alle typer bakterier, det vil si at det er tilfeller der fargingen ikke virker.

I dette tilfellet kan bakterier som mangler en cellevegg, nevnes. For eksempel: slekt Mycoplasma, sfæroplast, Ureaplasma, L-former og protoplaster.

Det flekker også dårlig bakterier med vegger rik på mykolsyre, som Mycobacteria og intracellulære bakterier som Chlamydias og Rickettsias.

Det er også ineffektivt å plette de fleste spirochetalbakterier.

Det er bakterier av samme slekt som kan observeres i samme prøve som Gram positiv og som Gram-negativ. Når dette skjer, kalles det variabel Gram-flekk, noe som kan skyldes endring i næringsstoffer, temperatur, pH eller konsentrasjon av elektrolytter..

Vanlige feil

Blek overdrevet

Overdriving i misfargingstrinnet kan føre til observasjon av falske gram-negative mikroorganismer.

Ikke vent på nok tørketid for å legge til nedsenkningsoljen:

Denne feilen forårsaker dannelsen av fete miceller som gjør det vanskelig å observere strukturer som er til stede. Dette skjer når oljen knyttes til vannmolekylene som er tilstede i smeten.

Omvendt rekkefølgen av reagensene:

En feil som dette vil føre til at Gram-negative bakterier viser lilla, det vil si falskt Gram-positivt.

Bruk gamle avlinger (fast eller flytende):

Det kan føre til at Gram-positive bakterier plager Gram-negativ (falsk Gram-negativ). Dette skjer fordi i de gamle kulturer er det sannsynlig at det er døde eller forverrede bakterier, og under disse forhold beholder bakteriene ikke den fiolette krystall.

Bruk svært gammel Lugol-løsning:

Over tid taper den sine egenskaper og fargen svimmer. Hvis det allerede degenererte reagenset blir brukt, vil det ikke fikse krystallviolen godt, derfor er det mulighet for å oppnå en visualisering av mikroorganismer som er falskt Gram-negativ.

Bluish bakgrunn

En riktig misfarget bakgrunn vil bli rød. En blå bakgrunn indikerer at misfargingen ikke var tilstrekkelig.

referanser

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. sherris. mikrobiologi Medisinsk, 6. utgave McGraw-Hill, New York, USA
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. utgave). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologisk diagnose av Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Editorial
  4. Casas-Rincón G. 1994. Generell mykologi. 2. utg. Universidad Central de Venezuela, Bibliotek utgaver. Venezuela, Caracas.
  5. "Gram stain" Wikipedia, Den frie encyklopedi. 4. oktober 2018, 23:40 UTC. 9. desember 2018, 17:11. Hentet fra es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Håndbok for medisinsk mikrobiologi. Andre utgave, Venezuela: Direktoratet for media og publikasjoner fra University of Carabobo.
  7. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C Colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas basiske fargestoffer i den mikrobiologiske laboratorier. Forskning om funksjonshemning. 2014; 3 (1): 10-18.