Wrights flekkfundament, materialer, teknikk og bruk



den Wrigths flekk er en fargeteknikk opprettet av den amerikanske patologen James Homer Wright i 1902, fra flekken av Romanowsky. Da Romanowskijs flekk var ustabil, innførte Wrigth metanol som løsningsmiddel og fikseringsmiddel.

Denne farge er polykromatisk, noe som betyr at genererer ulike farger avhengig av strukturen som absorberer fargestoff. Denne fargingen teknikken har blitt mye brukt for differensielle hvite blodcelletellinger og studere morfologi av røde blodlegemer, blodplater og hvite blodlegemer i perifert blod og benmarg.

Anvendelsen er svært viktig, da abnormaliteter kan ses i de forskjellige cellelinjene i blodet, og letter diagnosen sykdommer som leukemi eller bakterielle eller parasittiske infeksjoner.

Kanskje dette er de vanligste bruksområdene der denne teknikken brukes, men de er ikke de eneste. Det er også nyttig i andre prøver enn blod og benmarg, som prøver av neseutslipp, fekalslim, sputum, hud, blant andre..

index

  • 1 Foundation of Wrights flekk
  • 2 materialer
    • 2.1 Fremstilling
    • 2,2 Buffer buffer løsning
    • 2.3 Ytterligere materialer som trengs for å utføre fargen
  • 3 komponenter av Wrights flekk
    • 3.1 metanol
    • 3.2 Støtdemperen
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Methylenblå
  • 4 Teknikk
  • 5 verktøy
    • 5.1 Hematologi
    • 5.2 Nasal sekresjon
    • 5.3 Parasitologi
    • 5.4 Luftveisinfeksjoner
    • 5.5 Bakteriologi
    • 5.6 Mykologi
  • 6 Hvordan er strukturen i blodprøven observert med Wrights flekk??
  • 7 Anbefalinger for god farging
  • 8 Vanlige feil i Wrigth-farging
    • 8.1 Veldig blek farging
    • 8.2 Nedbør av fargestoffet
    • 8.3 Smør med ekstremt rødaktig eller blå farge
  • 9 Lagringsmodus
  • 10 referanser

Wrights flekkfundament

Wright flekk født Romanowsky-farging, som består av en oppløsning av metylalkohol et surt fargestoff (Eosin Y) og en basisk (metylen blå) og deres oksydasjonsprodukter.

Fargestoffet blanding brukt i Wright flekken har effekten kjent som Romanowsky, dvs. gir en vakker lilla farge til kjernen av leukocytter og nøytrofile granulater, mens røde blodceller er farget rosa.

Komponentene ansvarlig for å gi det typiske området av farger Wright flekken er blå B og eosin Y. Den observerte effekt er avhengig av bindingen av fargestoffer til de kjemiske strukturer og interaksjoner av blått B og Eosin Y.

Syriske strukturer som nukleinsyrer, nukleare proteiner og reaktiv, umodentlig cytoplasma av enkelte celletyper, fikser blå B (grunnleggende fargestoff).

Mens de grunnleggende strukturer som hemoglobin, korrigerer granulene i segmenterte eosinofiler, blant annet cellulære strukturer, eosin Y (sur fargestoff).

Resultatet av farging kan påvirkes av forskjellige faktorer, for eksempel pH i Wright-fargestoffet, bufferen og vaskeoppløsningen; samt farging og festingstid.

Derfor er hvert trinn i fremstillingen av reagensene avgjørende, og må gjøres og ta vare på hver detalj.

materialer

Wright-fargestoffer. For 100 ml er det nødvendig:

Veie 0,3 g Wright-fargestoff, måle 97 ml metanol og 3 ml glyserol.

forberedelse

I en mørtel legger du den store mengden Wrights fargestoff og sakte tilsetter glyserol til pulveret er fullstendig oppløst..

Deretter tilsettes metanolen, blandes og helles i en rav flaske.

Før du bruker løsningen, skal du riste med milde bevegelser og filter.

Buffered buffer

I en liter destillert vann ble 3,76 g dinatriumhydrofosfat (Na2HPO4   2H20) pluss 2,1 g kaliumdihydrogenfosfat (KH)2PO4).

Bland godt sammen til alle inkorporerte reagensene er oppløst. Juster pH til 7.2. Hell i glassglass og hold ved romtemperatur.

Ytterligere materialer som trengs for å utføre fargen

Arkene innføringsstykket eller dekkglasset, bro farve pisetas med vann eller buffer for vasking, en tidtaker for å bære fargetider og et tørkemateriale: i tillegg andre materialer for å utføre farveteknikk, disse er nødvendige (absorberende papir, gasbind eller bomull).

Wright flekk komponenter

metanol

Alkohol (metanol) fungerer som et fikseringsmiddel av blodspredningen til lysbildet.

I utgangspunktet er det et reduserende reagens, dehydrator og koaguleringsfixativ. Derfor er dens funksjon å koagulere proteinene og gjøre dem uoppløselige, men uten å få denaturere dem.

Metanol er det mest brukte reagenset for å fikse smør i alle laboratorier, da det gir bedre resultater enn de som er oppnådd med etanol. Den ideelle konsentrasjonen er 99%.

Støtdemperen

Bufferen (buffert løsning) har funksjonen til å justere eller opprettholde pH i fargestoffet, siden en pH justert til 7.2 er avgjørende for at cellestrukturer absorberer fargestoffer på riktig måte..

På den annen side dehydrerer passasjen av metanolfiksering cellene og bufferen bidrar til å rehydrere dem.

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet for grunnleggende komponenter fordi det er et syrefarger. To typer eosin er veldig lik hverandre, slik at en av de to kan brukes, og får samme resultat.

Den ene heter eosin Y, eosin gul eller Tetrabrom og andre eosin B, erythrosin B eller dibromodinitrofluoresceína blå. Imidlertid er eosin Y den mest brukte.

Den viktigste egenskapen til dette fargestoffet er dens negative polaritet, dette gjør det tiltrukket av cellulære strukturer med positiv ladning.

Methylenblå

Det er den grunnleggende fargen. Dens hovedegenskap er metakromasi, det vil si at ikke alle strukturer skal farges i samme farge, det avhenger av den kjemiske sammensetningen av strukturen at den farges.

Noen vil bli lys eller mørk blå og andre mørk lilla eller blek lilla.

teknikk

1-Utfør spredningen av prøven slik at en tynn film forblir, enten på et lysbilde eller en deksel.

2-La lufttørke i ca 2 timer.

3 - Legg det tørre smøremiddelet på flekkebroen eller fargebakken med prøven spredt oppover.

4-Dekk arket med Wright-fargestoffet dråpevis til det dekker hele overflaten. La igjen i 5 - 8 minutter.

5-Fargestoffet skal helt dekke lysbildet, uten å spyle over kantene. Hvis det i fargetiden begynner å fordampe, skal det legges ytterligere dråper.

6 - Legg deretter til en tilsvarende mengde støtdempere, blås litt inntil den karakteristiske metallskinnet vises. Ta 10 til 15 minutter.

7-Vask med vann fra springen, plasser den myke strålen til arket ser rosa ut.

8 - Med en gasbind impregnert med alkohol fjernes fargestoffet festet til baksiden av lysbildet.

9-Tillat at smeten tørker godt før du setter ned oljen for å visualisere den i mikroskopet.

utility

hematologi

Den er ideell for smøring av perifere blodutsmøringer, for å undersøke tykke blodutsmøringer og for å studere celler fra beinmargsprøver.

På grunn av de kjemiske egenskapene til denne kombinasjonen av fargestoffer, kan de cellulære strukturer lett gjenkjennes, idet de er i stand til å skille mellom de forskjellige celletyper som er til stede.

Nesekresjon

Denne teknikken er meget nyttig for å identifisere cellene i nasal sekresjonen (epitelceller, segmenterte eosinofiler, polymorfonukleære) ved diagnosen allergisk rhinitt.

parasittologi

I denne forstand har det vært nyttig for studiet av Leishmania sp innenfor histiocytene av det subkutane cellulære vevet i hudssår. På samme måte er det brukt til å identifisere leukocytter i avføringprøver (fekal leukogram).

I dette tilfellet er det av interesse for legen å vite om leukocytosen tilstede i avføringen er ved polymorfonukleær eller mononukleær. Dette funnet i fekal leukogrammet vil lede om det er en bakteriell eller viral infeksjon henholdsvis.

På den annen side kan parasittene som sirkulerer i blodet finnes i erytrocyten eller fritt i plasmaet. De ønskede parasittene er Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii og filarias, og i veterinærmedisin er det nyttig i søket etter Theileria equi og Babesia caballi, Causative agenter av babyer, spesielt i equines.

Wright og Giemsa flekken kan skille hemoparasitter fra normale cellulære komponenter. For dette kan du bruke to typer spreads:

Fine strekker

Blodet spres ut som en tynn film på et lysbilde. Farget med Wrights flekk som avslører kjennetegnene til kjernen og cytoplasma.

Tykk dråpe

Denne metoden brukes til å undersøke forekomsten av parasitter i en større mengde blod.

For dette plasseres en stor bloddråpe på et lysbilde. Når du er der, bør du defibrinere, og gjøre større og større sirkler fra sentrum utover, ved å bruke kanten av et annet lysbilde.

Til slutt, for å observere parasittene i det tykke smøret, må erytrocytene lyseres med vann.

Åndedrettsinfeksjoner

På luftveiene er denne teknikken også nyttig, fordi cellene tilstede i sputumprøver, bronkial eller bronkoalveolær spyling, er viktige for å etablere diagnosen.

På samme måte kan polymorfonukleære celler og mononukleære celler skiller seg ut her.

bakteriologi

Bruken av denne teknikken i bakteriologi er begrenset, fordi det ikke er bra for farging av bakteriene, det er derfor for farging av dem andre spesialiserte fargeteknikker brukes.

Det har imidlertid vært brukt til å lete etter epitelceller med inkluderingsorganer av Chlamydia trachomatis i utstryk av urinrøret eller endocervikal slimhinne, selv om det må anerkjennes at det ikke er den beste metoden for dette.

Det er også mulig å observere spiral-type bakterier blant de røde blodcellene som Borrelia burgdorferi hos infiserte pasienter, samt morulae eller inkluderingsorganer av Ehrlichia sp i cytoplasma av lymfocytter, monocytter eller nøytrofiler i et blodsprøyt.

mykologi

den Histoplasma kapulatum er en patogen sopp ofte diagnostisert ved mikroskopisk observasjon av forskjellige vevsprøver, farget med Wrights flekk.

Hvordan blir strukturen av blodprøven observert med Wrights flekk?

Anbefalinger for god farging

Utvidelser av blodprøver bør lufttørkes spontant. Smørene skal være så tynne som mulig for å få bedre fiksering av fargestoffet og unngå overkollering.

For farging av høy kvalitet anbefales det å utføre fargingen i løpet av de to timene som følger etter smøring. På den annen side er den ideelle prøven kapillært blod uten antikoagulant.

Men hvis venøst ​​blod brukes, bør det brukes som EDTA-antikoagulant og ikke heparin, siden sistnevnte kan deformere cellestrukturer.

For å hindre forringelse av preparert fargestoff bør oppbevares på tørre steder.

Under vaskeprosessen anbefales bruk av vann justert til nøytral pH.

Til slutt er det tilrådelig å teste fargemetoder som brukes i laboratoriet hver så ofte.

Dette gjøres ved å fargelegge prøver eller utvidede mønstre, som kvalitetskontroll. Dette trinnet er viktig, da dette sikrer at fargingen er ordentlig forberedt og fargetidene er godt standardisert.

Hvis mønsterarket er dårlig farget, er det problemer som må løses.

Vanlige feil i Wrigth farging

Veldig blek farging

Veldig bleke utsmykninger, vanligvis på grunn av svært kort tid for farging eller en svært overdrevet vask. Det korrigeres ved lengre kontakttid med fargestoffet eller ved å redusere vasketiden.

Fargestoffer faller ut

Tilstedeværelsen av fargestoffer i smeten kan ha flere årsaker, men de vanligste årsakene er: bruk av ufiltrert fargestoff, flekker på ujevne fargebroer, bruk skitne ark med støv eller fett, ikke gjør en god vask på Avslutt fargingen.

Smør med ekstremt rødaktig eller blå farge

Bufferen er ansvarlig for pH-verdien av fargestoffet. Farger med pH under det angitte (syre) vil resultere i meget røde smører.

Hvis pH i fargen er over (alkalisk), vil det oppnås et ekstremt blåaktig smear.

Lagringsmodus

Reagenset bør oppbevares ved romtemperatur.

referanser

  1. V. Gutierrez sammenlignende undersøkelse mellom Wright fargemetode og ELISA-test for påvisning av canine ehrlichiosis i byen San Pedro Sula, Honduras. 2008. Avhandling for å søke om Tittel for Veterinær Leger. Universitetet i San Carlos de Guatemala.
  2. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C Colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas basiske fargestoffer i den mikrobiologiske laboratorier. Forskning om funksjonshemning. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrights flekk." Wikipedia, Den frie encyklopedi. 18. mai 2018, 12:05 UTC. 8. desember 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvens av Babesia spp. i hester av montería, Córdoba (Colombia). Rev. utcaactual divulg cient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiologisk diagnose av Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Helseinstituttets regjering i Chile. Anbefalinger for å fargelegge blodutløser for å lese blodtallet.